DAUDZZIEDU AIRENES RAIBUMA VĪRUSA SERĪNA PROTEĀZES STRUKTURĀLIE PĒTĪJUM

Abstract

Bakalaura darbs tika izstrādāts no 2019. gada septembra līdz 2020. gada maijam Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrā, Augu virusoloģijas laboratorijā Dr. biol. Andra Zeltiņa un Dr. biol. Inas Baļķes vadībā. Pētījuma objekts ir daudzziedu airenes raibuma vīrusa serīna proteāze. Sobemovīrusu serīna proteāzes veic poliproteīnu 2a un 2ab šķelšanu pa specifiskiem šķelšanas saitiem funkcionālajos domēnos. Proteāžu katalītiskā centra triādes aminoskābes ir D-H-S, kuru nomaiņa samazina vai inaktivē to katalītisko darbību. 3D struktūra ir publicēta tikai Sesbānijas mozaīkas vīrusam. To veido divas β mucas, kas savienotas ar garu starpdomēnu cilpu. Proteāzes pieder pie glutamil-peptidāzēm, kas ir serīna proteāzes, kas šķel peptīdsaiti aiz glutamīnskābes. Gutamīnskābes saitošo saitu (S1-saistošā kabata) SeMV veido H298, T279 un N308. Kursa darbā tika izveidoti ekspresijas konstrukciju vektori pET-Δ117Procm-N6H (nesatur transmembranālo domēnu) un pET-Δ50Procm-N6H (ar transmembranālo domēna daļu bez pirmajām 50 aminoskābēm un tā šķelšanas saitu E/A), kuriem katalītiskā centra aminoskābe S159 tika nomainīta uz A. Bakalaura darbā šie konstrukti tika ekspresēti E. coli sistēmā C2566 un attīrīti. Δ117Procm tika veikta arī kristalizācija ar un bez sintētiskā peptīda, kā arī ar rentgenstaru difrakcijas metodi noteikta 3D struktūra Δ117Procm ar sintētisko peptīdu, taču Δ50Procm agregējās attīrīšanas procesā.

This Bachelor’s thesis was developed from September 2019 until May 2020 in Latvian Biomedicine research and study centre, in plant virology laboratory in the guidance of Dr. Biol Andris Zeltiņš and Dr. Biol Ina Baļķe. The object of this thesis is ryegrass mottle virus serine protease. Sobemoviral serine proteases cleave polyproteins 2a and 2ab on specific sites in their functional domains. Protease catalytic centre triad amino acids are D-H-S, the substitution of whom stops polyprotein cleaving. At this moment only Sesbania mosaic virus’s 3D structure has been established. It is made of two β barrels that are connected with a long interdomain loop. These proteases are glutamyl peptidases, which are serine proteases that cleave the peptide site after glutamic acid. The amino acids that make up the glutamic acid binding site (S1-binding cleft) for SeMV are H298, T279 and N308. Previously, two expression vectors were made - pET-Δ117Procm-N6H and pET-Δ50Procm-N6H. For both, the catalytic centre’s amino acid S159 was substituted by A. Both constructs were expressed in E. coli strain C2566 and purified. Δ117Procm was crystallized with and without syntethic peptide and 3D structure was established for Δ117Procm with syntetic peptide by X-ray difraction methode, however Δ50Procm aggregated during the purification process.