Daudzgadīgās airenes Lolium perenne agrobaktērijas transformācija CBF6 kandidātgēnam, konstrukta sagatavošana un pārbaude

Abstract

Līdz ar klimata pārmaiņām tiek paredzēts paaugstināts apjoms ekstremālu temperatūru un bargāki laikapstākļi, un ir nepieciešams savlaicīgi meklēt risinājumus, kā nezaudēt šo cīņu. Kā viens no potenciāliem augiem, kuru būtu nepieciešams papildus pētīt dotajā jautājumā ir daudzgadīgā airene (Lolium perenne), kas ir visplašāk audzētā un vēsās sezonas ekonomiski nozīmīga daudzgadīga graudzāle. Daudzgadīgo aireni plaši kultivēta visā pasaulē tās lopbarības kvalitātes, augstās ražas, ganību tolerances un ilgās augšanas sezonas dēļ, tomēr atsevišķas īpašības, piemēram, nepietiekama izturība pret abiotisko stresu kavē plašāku audzēšanu Baltijas valstīs. Pēdējos desmit gados strauji attītās genoma rediģēšanas metodes, izmantojot CRISPR/Cas9 sistēmu, kas potenciāli ļauj veikt izmaiņas genomā neienesot tur svešus gēnus, tādējādi veicinot genoma funkcionālos pētījumus un tālākā nākotnē piedāvājot paātrinātu jaunu augu šķirņu veidošanu. Darba mērķis bija veikt daudzgadīgās airenes agrobaktērijas (Agrobacterium tumefaciens) transformāciju, iegūstot reģenerētus augus ar inaktivētu CBF6 gēnu, lai pārbaudītu šī gēna lomu daudzgadīgās airenes abiotiskā stresa izturībā. Maģistra darba ietvaros tika veikta CBF6 kandidātgēna atlase L.perenne genomā, tā galamērķa vektora dizainēšana agrobaktēriju transformācijai, kallusu atlase, izmantojot reportiergēnu ZsGreen un reģenerētu transformētu augu ieguve ar mutācijām CBF6 kandidātgēnā. Transformācijas ietvaros tika iegūti 189 kalusi, no četriem agrobaktērijas celmiem:82 -AGL1, 70 - EHA105, 26 - ITC340 un 11 – LBA4404. No tiem iegūti seši transformēti L.perenne augi, kuriem vismaz no EHA105 un ICF340 līnijām ir novērojamas lielizmēra delēcijas. Novērots, ka uz kopējo kallusu skaitu no EHA105 celma tika iegūts 1.43%, AGL1 6.1 % un ICF340 23.08% potenciāli transformēti augi ar normālu attīstību.

Climate change increases the amount of extreme temperatures and severe weather events, due to that it is necessary to find new solutions to help plants fight these changes. Perennial ryegrass (Lolium perenne) is the most widely cultivated and Economically important cool-season perennial grass and is one of the potential plants that should be further studied in the given situation. It is actively cultivated worldwide due to its forage quality, high yield, grazing tolerance and long growing season, however, certain characteristics, such as insufficient resistance to abiotic stress, prevent wider cultivation in the Baltics. In the last ten years, genome editing methods using the CRISPR/Cas9 system have developed rapidly, which potentially allows changes to be made in the genome without introducing foreign genes, thus promoting functional genome research and offering accelerated development of new plant varieties in the future. The aim of the work was to perform the transformation of the perennial ryegrass agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) by obtaining regenerated plants with an inactivated CBF6 gene, in order to test the role of this gene in the abiotic stress resistance of the perennial ryegrass. Within the framework of the master’s thesis, the selection of the CBF6 candidate gene in L. perenne, the design of its destination vector for agrobacterial transformation, the selection of callus using the reporter gene ZsGreen and the production of regenerated transformed plants with an inactivated CBF6 gene region were carried out. From the transformation, 189 calli were obtained from four agrobacterium strains, of which 82 - AGL1, 70 - EHA105, 26 - ITC340 and 11 - LBA4404. From them, six transformed plants of L. perenne were obtained, which at least from EHA105 and ICF340 lines have observed large deletions, it was observed that 1.43%, AGL1 6.1% and ICF340 23.08% of the total number of callus were obtained from EHA105 strain, 23.08% potentially transformed plants with normal development were obtained.