Amdoriāzes mutantu ekspresija, attīrīšana un raksturošana glicēta hemoglobīna noteikšanai

Abstract

Fruktozīla peptīdu oksidāzes, ko dēvē arī par amadoriāzēm, ir no FAD atkarīgo enzīmu klase, ko var izmantot diabēta diagnostikas testos. Tomēr, ņemot vērā dažus esošos ierobežojumus to lietojamībai, proti, piekļuves tuneļa lielumu tā aktīvam centram, šie enzīmi ir jāveic dažadās izmaiņas proteīna sekvencē, lai varētu izstrādāt lētu un ērti lietojamu diabēta uzraudzības ierīci. Šī darba mērķis ir novērtēt divu jaunu amadoriāzes mutantu - D7 un D11- termostabilitāti, aktivitāti un strukturālās iezīmes, kas veidotas, balstoties uz mutanta (X02C), kurš iepriekš bija izstrādāts un raksturots mūsu laboratorijā. Lai sasniegtu šos mērķus, proteīni tika biosintezēti E. coli šūnās. Pēc tam abus mutantus attīrīja, izmantojot niķeļa afinitātes hromatogrāfijas un izmēru izslēgšanas hromatogrāfijas kombināciju. Abu mutantu termostabilitāti un sekundārās struktūras analizēja noteica ar cirkulāro dihroismu. Enzimātiskus testus veica ar dabisko substrātu – fruktosila-VH (f-VH) dipeptīdu, lai novērtētu enzīmu aktivitāti. Viens no diviem enzīmiem (D7) tika kristalizēts, izmantojot tvaiku difūzijas metodi. Struktūra tika atrisināta ar molekulāru nomaiņu un precizēta, ar izšķirtspēju 2.1 Å. Lai gan abiem mutantiem bija mazāka termostabilitāte un mazāks biosintēzes iznākums, salīdzinot ar pamatenzīmu, to aktivitāte uz f-VH palielinājās, tomēr ar lielāku substrātu nebija iespējams noteikt tā aktivitāti.

Fructosyl peptide oxidases, also known as amadoriases, are a class of FAD-dependent enzymes that can find application in diagnostics tests for diabetes. However, owing to some existing limitations to their usability, namely the size of accessions tunnel to their active site, these enzymes must be extensively engineered to allow the development of a cheap and easy-to-use diabetes monitoring device. The aim of this work is to evaluate the thermostability, the activity and the structural features of two novel amadoriase mutants, D7 and D11, which have been designed based on a mutant (X02C) previously designed and characterized in our group. To achieve these goals, proteins were produced in E. coli cells. The two mutants were then purified using a combination of nickel affinity chromatography and size exclusion chromatography. The thermostability and and secondary structures of the two mutants were analyzed using circular dichroism. Enzymatic assays were performed on the natural substrate, the fructosyl-VH (f-VH) dipeptide, to assess the activity of the enzymes. One of the two enzymes (D7) was crystallized using the vapor diffusion method. The structure was solved by molecular replacement and refined at 2.1 Å resolution. While both mutants showed reduced thermostability and lower expression yield compared to their parent enzyme, their activity on f-VH increased. However, no measurable activity could be detected on larger substrates.